Cours : Cinétique enzymatique

Cinétique enzymatique - Fiche de cours (BCPST1)

Introduction et Définitions fondamentales

La cinétique enzymatique a pour objet l’étude quantitative de la vitesse des réactions catalysées par des enzymes et des facteurs qui l’influencent.

Enzyme : Catalyseur biologique (majoritairement protéique, parfois ARN - ribozyme) qui accélère une réaction thermodynamiquement possible sans être consommé ni modifié de façon permanente à la fin de la réaction.
Substrat ( $\text{S}$ ) : Molécule transformée en produit ( $\text{P}$ ) grâce à l’action de l’enzyme ( $\text{E}$ ).
Complexe enzyme-substrat ( $\text{ES}$ ) : Intermédiaire réactionnel non covalent indispensable formé lors de la catalyse.

Le schéma réactionnel de base (modèle de Michaelis et Menten) est le suivant :

$\text{E} + \text{S} \underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{\rightleftharpoons}} \text{ES} \overset{k_2}{\longrightarrow} \text{E} + \text{P}$

$k_1$ : constante de vitesse de formation du complexe $\text{ES}$ ( $\text{L}\cdot\text{mol}^{-1}\cdot\text{s}^{-1}$ ).
$k_{-1}$ : constante de vitesse de dissociation du complexe $\text{ES}$ ( $\text{s}^{-1}$ ).
$k_2$ (ou $k_{\text{cat}}$ ) : constante catalytique ou nombre de turnover, vitesse de la réaction chimique proprement dite ( $\text{s}^{-1}$ ).

Le Modèle de Michaelis-Menten

1. Hypothèses du modèle

Stationnarité (approximation de Bodenstein) : Après un transitoire très court, la concentration du complexe $\text{ES}$ est considérée comme constante au cours du temps : $\frac{d[\text{ES}]}{dt} \approx 0$ .
Conditions initiales : On mesure la vitesse initiale ( $v_i$ ). À $t=0$ , $[\text{P}] = 0$ , donc la réaction inverse ( $\text{P} \rightarrow \text{S}$ ) est négligeable. De plus, $[\text{S}] \approx [\text{S}]_0$ .
Conservation de l’enzyme : L’enzyme totale ( $\text{E}_t$ ) se trouve sous forme libre ( $\text{E}$ ) ou liée ( $\text{ES}$ ) : $[\text{E}]_t = [\text{E}] + [\text{ES}]$

2. Démonstration de l’équation de Michaelis-Menten

Exprimons la vitesse initiale $v_i$ de formation du produit : $v_i = \frac{d[\text{P}]}{dt}_{(t=0)} = k_2 [\text{ES}]$

Appliquons l’approximation de Bodenstein sur le complexe $\text{ES}$ : $\frac{d[\text{ES}]}{dt} = k_1 [\text{E}][\text{S}] - k_{-1}[\text{ES}] - k_2[\text{ES}] = 0$

En remplaçant $[\text{E}]$ par $[\text{E}]_t - [\text{ES}]$ : $k_1 ([\text{E}]_t - [\text{ES}])[\text{S}] - (k_{-1} + k_2)[\text{ES}] = 0$

Développons et factorisons par $[\text{ES}]$ : $k_1 [\text{E}]_t [\text{S}] - k_1 [\text{ES}][\text{S}] - (k_{-1} + k_2)[\text{ES}] = 0$ $k_1 [\text{E}]_t [\text{S}] = [\text{ES}] \left( k_1 [\text{S}] + k_{-1} + k_2 \right)$

D’où : $[\text{ES}] = \frac{[\text{E}]_t [\text{S}]}{\frac{k_{-1} + k_2}{k_1} + [\text{S}]}$

On pose la constante de Michaelis, notée $K_m$ : $K_m = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}$ (Note : $K_m$ s’exprime en $\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}$ . C’est une concentration, pas une constante d’affinité thermodynamique stricte, bien qu’elle y soit reliée).

On obtient alors : $[\text{ES}] = \frac{[\text{E}]_t [\text{S}]}{K_m + [\text{S}]}$

En injectant dans l’expression de $v_i$ : $v_i = k_2 [\text{E}]_t \frac{[\text{S}]}{K_m + [\text{S}]}$

La vitesse maximale $V_{\text{max}}$ est atteinte lorsque toute l’enzyme est sous forme liée ( $\text{ES}$ ), c’est-à-dire quand $[\text{S}] \gg K_m$ (saturation) : $V_{\text{max}} = k_2 [\text{E}]_t$

D’où l’équation de Michaelis-Menten : $\boxed{v_i = \frac{V_{\text{max}} [\text{S}]}{K_m + [\text{S}]}}$

Propriétés fondamentales de la constante de Michaelis ( $K_m$ )

Signification graphique : $K_m$ est la concentration en substrat pour laquelle la vitesse initiale est égale à la moitié de la vitesse maximale ( $v_i = \frac{V_{\text{max}}}{2}$ ).
Signification biochimique :
- Si $K_m$ est faible, l’affinité de l’enzyme pour son substrat est forte (il faut peu de $\text{S}$ pour saturer l’enzyme à moitié).
- $K_m$ dépend de l’enzyme, du substrat considéré, du pH et de la température.

Représentations Linéarisées (Méthodes d’étude expérimentale)

L’exploitation directe de l’hyperbole de Michaelis ( $v_i = f([\text{S}])$ ) est peu précise pour déterminer $V_{\text{max}}$ et $K_m$ . On utilise des transformations mathématiques.

Représentation de Lineweaver-Burk (des doubles inverses)

On prend l’inverse de l’équation de Michaelis-Menten : $\frac{1}{v_i} = \frac{K_m + [\text{S}]}{V_{\text{max}} [\text{S}]} = \frac{K_m}{V_{\text{max}}} \cdot \frac{1}{[\text{S}]} + \frac{1}{V_{\text{max}}}$

C’est l’équation d’une droite de type $y = ax + b$ $y = a x + b$ avec :
- $y = \frac{1}{v_i}$
- $x = \frac{1}{[\text{S}]}$
- Pente $a = \frac{K_m}{V_{\text{max}}}$
- Ordonnée à l’origine $b = \frac{1}{V_{\text{max}}}$
- Intersection avec l’axe des abscisses : $x = -\frac{1}{K_m}$

Inhibition Enzymatique

Un inhibiteur ( $\text{I}$ ) est une molécule qui diminue la vitesse d’une réaction enzymatique. On distingue deux grands types d’inhibiteurs réversibles :

1. Inhibition compétitive

Mécanisme : L’inhibiteur ressemble structuralement au substrat et se fixe de manière réversible sur le site actif de l’enzyme. La fixation de $\text{S}$ et de $\text{I}$ s’excluent mutuellement.
Conséquences cinétiques :
- $V_{\text{max}}$ inchangée (en présence d’une forte concentration de substrat, on déplace l’inhibiteur, l’enzyme retrouve sa vitesse maximale).
- $K_m$ apparente augmentée ( $K_{m,\text{app}} > K_m$ ), car l’affinité apparente de l’enzyme pour le substrat diminue.
Lineweaver-Burk : Les droites avec et sans inhibiteur se coupent sur l’ordonnée à l’origine ( $\frac{1}{V_{\text{max}}}$ ).

2. Inhibition non compétitive (ou incompétitive / mixte selon les cas rigoureux, version classique BCPST)

Mécanisme : L’inhibiteur se fixe sur un site distinct du site actif (site allostérique), que l’enzyme soit libre ou liée au substrat ( $\text{ES}$ ).
Conséquences cinétiques :
- $V_{\text{max}}$ diminue ( $V_{\text{max,app}} < V_{\text{max}}$ ), car une fraction de l’enzyme est rendue définitivement inactive par l’inhibiteur, peu importe $[\text{S}]$ .
- $K_m$ inchangée (dans le modèle strict non compétitif pur).
Lineweaver-Burk : Les droites se coupent sur l’axe des abscisses ( $-\frac{1}{K_m}$ ).

Méthodes et Démarches en BCPST

Vérifier la validité des conditions initiales : Toujours s’assurer que la mesure de $v_i$ est faite sur la portion linéaire de la courbe $[\text{P}] = f(t)$ (généralement dans les premières minutes).
Identifier graphiquement les paramètres : Savoir lire $V_{\text{max}}$ et $K_m$ sur une courbe $v = f([\text{S}])$ et sur une droite de Lineweaver-Burk.

Pièges Classiques à Éviter

Confondre $K_m$ et affinité : Plus $K_m$ est petit, plus l’affinité est grande. Ne pas dire “l’affinité est égale à $K_m$ ”.
Oublier les unités : $v_i$ est en $\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}\cdot\text{s}^{-1}$ (ou $\mu\text{mol}\cdot\min^{-1}$ ), $K_m$ en $\text{mol}\cdot\text{L}^{-1}$ , et $V_{\text{max}}$ a la même unité que $v_i$ .
Mauvaise interprétation de Lineweaver-Burk : L’erreur classique est d’oublier que l’axe des abscisses représente $\frac{1}{[\text{S}]}$ et non $[\text{S}]$ . Une valeur lue à l’origine doit être inversée pour obtenir $K_m$ ou $V_{\text{max}}$ .
Causalisme erroné en cinétique : L’enzyme ne “modifie pas l’équilibre thermodynamique” d’une réaction ( $\Delta_r G$ reste inchangé), elle accélère seulement l’atteinte de cet équilibre en abaissant l’énergie d’activation ( $\Delta G^\ddagger$ ).